Darwiniana

Uz nebudem prispevky tykajuce sa TC davat pod temu 'agar' pretoze uz je to trochu off topic. Moj dotaz sa tyka rastucich explantatov. Najprv som sem chcel prilepit fotky semenacikov na mediu, rastu velmi rychlo:
d.burmanni (2 tyzdne)


d.burmannii (5tyzdnov)


d.anglica (2tyzdne)


d.anglica (necele 4 tyzdne, zacina korenit)


Niektore druhy lahko rastu bez hormonov a priamou organogenezou tvoria ako listy, tak aj korene. Ine druhy sa ale na mediu bez hormonov nedari mnozit. Nesplesniveju, su sterilne, neumru na mediu, ale ani netvoria nove rastlinky. Iba normalne rastu ako keby boli na materskej rastline. Tak sa mi stalo, ze po 2 tyzdnoch mi povodne nevyvinuty na mediu polozeny kvetny stvol d. rotundifolia najprv zacal rast dohora, potom vykvitol a teraz tvori semienka!


Explantaty listov d. filiformis netvoria adventivne pupene ale normalne sa vyvijaju a rosia na mediu:


..podobne sa chova i d.derbynensis a niektore dalsie druhy. Znamena to, ze sa u nich musi pouzit urcite mnozstvo cytokininov a/alebo auxinov na nastartovanie organogenezy?

(Zatial najlahsie sa mi zda mnozenie na mediu zo semien,po 10 dnoch klici aj d. ascendens):


Za pripadne reakcie dakujem



Upraveno 1 krát. Naposledy upravil Dusan Klasovity (15.09.2009 20:12)

U květního stvolu D.rotundifolia to vypadá na bakteriální kontaminaci - te bílý zákal kolem explantátu

Ahoj Milos, ten biely zakal okolo explantatov (tvori sa mi asi v 40% pripadov, i tych explantatov, co uz rastu) bude pravdepodobne fenolicka exkrecia (fenolove krvacanie) explantatov (vsetkych typov okrem semien). Cital som, ze je najintenzivnejsie prave v obdobi, ked sa rastlina chysta mnozit. Bakterialna kontaminacia to podla mna nebude, pretoze bakterie rastu v koloniach so specifickymi tvarmi a siria sa spravidla vsetkymi smermi, co u tohto nepozorujem. Pohare su naklonene v 30st. uhle a exkrecia smeruje len jednym smerom od explanatu dolu. Mimo to som nasiel vo vzorke velke mnozstvo kyseliny 3,4,5-tetrahydroxybenzoovej (k. gallovej) na HPLC (voda-acetonitril, 40-60), co je fenolicka zlucenina. Tym explantatom, co rastu, to zatial nevadi, tato latka ma antibakterialne a antioxidacne ucinky. Niekedy sa mi ale stane, ze ak je toho vela, obali to explantat a 'zadusi' ho. Vraj sa to da potlacit cysteinom, ale ten inhibuje i mnozenie. Najschodnejsie bude asi ked pouzijem karborafin (aktivne uhlie s velkym povrchom v mediu), ktory to bude pohlcovat, nie? Samozrejme sa ale mozem mylit.

Bakterie (nebo kvasinky) by to klidně mohly být (vzhledově by to odpovídalo) - podle toho jak rostou kolem toho květního stvolu, by to vypadalo na kontaminaci právě z rostliny (rozrůstají se po povrchu agaru pouze kolem a pak z kopce dolů).
Na druhou stranu, pokud máš pravdu a bakterie to nejsou, tak je to jedno, protože rostlince je to očividně jedno (i kdyby to byly bakterie) - nevadilo jí to před ustřižením a asi jí to nevadí ani teď .
Co se týče toho růsu v char. koloniích... Kolonie vzniká původně pouze z jedné bakterie. Pokud jich bylo poblíž víc, každá vytvoří kolonii a ty když dorostou do dostatečné plochy, tak mohou splynout. Proto se provádí izolace z inokula, aby pak kolonie vyrostly dál od sebe a mohlo se s nimi dál manipulovat.
Mám jednoduchý nápad, jak potvrdit/vyvrátit doměnku že jde/nejde o baktere. Něčím sterilním (např vyžíhaným a vychladlým drátkem, pokud máš platinový drátek, tak si můžeš jednodušše udělat bakteriologickou kličku) naber malé množstvý té látky, a pokud máš někde trochu volného zbytku agaru, nakresli na jeho povrchu klikatici a počkej. Když se tam nevytvoří nové kolonie, tak to bakterie určitě nebyly. Nechal bych tomu stejné kultivační podmínky (a dobu), jako má (měl) ten explanát.
Mylsím, že je to mnohem jednodušší na provedení a mnohem ekonomičtější, než provádět chromatografii . Pokud máš ale k HPLC přístup, tak to očividně není žádný problém a skoro všichni mohou tiše závidět.

Jinak - přijde mi opravdu úžasný, že ti ten květní stvol vykvetl! Škoda že nejsou fotky v květu .

__________________________
---Slávek---
email: slavek(zav.)mh2net(.)net
[i]Pěstované:Darwiniana nebo CPUK
Sbírka - fotky naleznete někde tu: Fotky

Fenolicke slouceniny to podle me na 99% nejsou, ty jsou prevazne hnede az cerne.Bakterie na mediich rostou tam kde se jim nejlepe dari, tj. kolem explantatu ( protoze tohle medium neni delane pro rust bakterii ale rostlin ). Pokud medium ale obsahuje dostatek proteinu nebo aminokyselin napr. pepton trypton tak ti bakterie poroste kdekoliv na mediu, tak jak to vidas na obrazcich. Muzes udelat screening toho povlaku a pasaznout ho na bakterialni agar a za 3 dny uvidis jestli to poroste.Podle me to je bakterie jako vysita.

Pak by to mohla byt smes. Barva fenolickych sloucenin SILNE zavisi na pH. Zkusim toho trosku hodit na solne mannitolove medium na Petriho misku co to udela, hodim to do inkubatoru na 37C pro urychleni a uvidime. Kdyz tak sem hodim fota. Jo a jestli se to potvrdi mel bych dyl sterilizovat abych se toho zbavil? Nebo spis pouzit naky sirokospektralni antibiotikum? Jo diky za reakci
Miroslav: no to jsem byl prave na dovolene kdyz to kvetlo, taky jsem si rikal ze to mohlo supr vypadat HPLC mam u sebe v laborce takze to problem neni. Jen casu je malo protoze tohle neni jaksi muj "hlavni ukol" v laborce Jesteze mam tolerantniho sefa

Miroslav, to s tou klikatici je dobrej napad. mam tu kontrolni sterilni sklenici se stejnym mediem v pondeli odeberu vzorek a uvidime.

Bakterie ti vyrostou i na chudém agaru - je potřeba aby ale měl základní živiny - např. tzv. minimální médium (minerální např. obsahuje pouze glukosu a anorganické látky). Je tam samozřejmě menší rychlost růstu (celý syntetický aparát je zaměstnán) než v komplexním médiu. Pro kvalitní a rychlý růst, ale potřebuje právě zdroj uhlíku a dusíku (jak zmínil p.Šula). Samozřejmě je ale mnohem jednodušší vyvařit např. zvířecí játra nebo maso, brambory, vajíčka, soyu, rýži či mléko a extrakt přidat do média.
Jako základní médium se používá např. MPA (masopeptonový agar). Nebo si prostě sehnat komerční základ pro základní bakteriologické půdy.

__________________________
---Slávek---
email: slavek(zav.)mh2net(.)net
[i]Pěstované:Darwiniana nebo CPUK
Sbírka - fotky naleznete někde tu: Fotky

S tím slaným agarem s manitolem ale nevím. Většina bakterií neni tolerantní k vyššímu obsahu soli v prostředí. Vámi zmiňovaný slaný agar s manitolem používá v lékařské mikrobiologii např. k identifikaci S.aurea (nevadí mu sůl a fermentuje manitol, mění tak pH a fenolová červeň jako indikátor změní barvu) a 37°C se používá kůli imitaci teploty lidského těla. Enviromentální bakterie většinou žijí při mnohem nižších teplotách a některé třeba nemusí mít rády vyšší teploty, takže bych jednu plotnu hodil do inkubátoru a druhou nechal při pokojové teplotě.

__________________________
---Slávek---
email: slavek(zav.)mh2net(.)net
[i]Pěstované:Darwiniana nebo CPUK
Sbírka - fotky naleznete někde tu: Fotky

Ještě k tý sterilizaci. Myslíš tím sterilizovat agar nebo rostliny? Pokud myslíš rostliny, pak by mě zajímalo čím je sterilizuješ, aby je to nepoškodilo. Pokud agar, a je to opravdu kontaminace, pak tím, že ho budeš déle nebo lépe sterilizovat, nic nezískáš.
Já osobně jsem silně proti používání ATB. Nemusí zabrat (nebo spíš nezaberou) proti všemu (musel bys vědět co je tou kontaminující bakterií/bakteriemi a zvolit tak ATB nebo kombinaci více ATB ) a navíc by se ti mohly časem vyskytnout rezistentní kmeny, takže bys musel používat stále silnější ATB (nebo slabší ale zcela jiné struktury/skupiny), nebo je střídat (jiný typ, jiná skupina) a předejít tak tomu. Ale budu se již opakovat, já nejsem nakloněný používání ATB (proč a celá problematika je trochu mimo arwinianu i tuhle "konverzaci" ).

__________________________
---Slávek---
email: slavek(zav.)mh2net(.)net
[i]Pěstované:Darwiniana nebo CPUK
Sbírka - fotky naleznete někde tu: Fotky



Upraveno 1 krát. Naposledy upravil Miloslav Macháček (04.09.2009 14:54)

Podle me je to z rostlin, vypadaji nejak moc zachovale, na to ze byli sterilizovany. S tema antibiotikama souhlasim, nejdrive je dobre bakterii identifikovat a pak teprve zvolit antibiotikum. To, ze je sirokospektralni ti vubec nezaruci vysledek. Daleko jednodussi je zacit znova a pouzit silnejsi sterilizaci.

To som potreboval vediet. Ja pri sterilizacii postupujem od najmensich koncentracii a najkratsich casov smerom k intenzivnejsej sterilizacii. Takze pocet kontaminacii sa znizuje postupne. Kontaminacia media (z komponentov alebo naboby) uz nenastava, takze ako hovori pan Sula to bude v explantatoch. Len som chcel vediet ci je to normalne ze explantat rastie namiesto toho aby nastala organogeneza na mediu bez hormonov. Inak mam dost velky problem zohnat myo-inositol (B8). Lekarne a obchody so zdravou vyzivou som zavrhol, pretoze na mna pozerali ako bager na tvrdu hlinu. Online obchody uctuju za postovne viac ako stoji samotna polozka. Neviete kde sa da par gramov zohnat? Dakujem

Fenolické sloučeniny se budou projevovat především z řezné plochy explantátu a ne z plochy listu. Dušane asi Tě zklamu, ale je to ta horší varianta. Musíš trochu přitvrdit při sterilizaci. Ošetření antibiotiky je lépe provést před sterilizací. Do média jej už nedávat.
Michal

Diky Michal. No sklamany nie som, vacsinou im to nevadi ale ked to budem chciet mat ciste tak pritvrdim v tej sterilizacii. Pridavat ATB nebudem, najprv musim ovladnut zaklady. Dakujem za plodnu diskusiu.

Hej mali ste pravdu, mimo fenolov tam su aj kvasinky. Zajtra pritvrdim pri sterilizacii, dufam, ze to neprezeniem. Taktiez u druhov, ktore nechceli na samotnom mediu rast skusim pouzit 0,2mg BAP a 0,05mg NAA.(Teda vsade okrem semien, tie hormony podla mna nepotrebuju co pozorujem).Proti pripadnym kvasinkam pre istotu 1,0ml PPM. Snad ich to prinuti k nejakej akcii

d. burmannii (semenace po 7 tyzdnoch od vysevu na medium, mesiaci od klicenia):


d.anglica (3 tyzdne od zaciatku iniciacie, kontaminacia kvasinkami)


d.ascendens (klicenie po 10 dnoch od vysevu)


d.ascendens (6dni stare semenaciky)


iniciacia pukov na kvetnom stvole po 3 tyzdnoch na mediu, d.affinis

Dobry vecer!
Dnes som vylahvil svoj prvy uspesny vysev na tkanivovej kulture. Takto vyzera d. burmannii po vylahveni (2 mesiace od prveho obrazku v tomto vlakne) Rastliny maju nad 1cm, korene zhruba rovnako dlhe, pocetne.

...a zasadene:


...ked to zosumarizujem, na ploche 5x6cm sa za 2 mesiace vypestovalo 93 dospelych rastlin d. burmannii ( ked pocitam aj tie, co som presadil do subkultury na nove medium). U d. anglica boli pouzite 2 listy. Tu sa vytvorilo za rovnaku dobu 28 novych rastlin. Zaujimave je, ze na tom istom mediu drosera burmannii tvori masivny korenovy system, zatial co d. anglica sa bude musiet zakorenit pocas aklimatizacie.


Rastliny su fotene hned po vybrati z kultury, takze su trosku este v soku. Som zvedavy, aky bude survival rate.

To je armáda burmannek !!!

_______________________________________________________
web growlist nabídka MR | jakubstepan@jakubstepan.com | Facebook

Fascinující... fakt armáda kytek

UPDATE: po 2 tyzdnoch som zistil, ze u burmaniek prezilo 100% vylahvenych rastlin, takto vyzeraju dnes (vacsina bude kvitnut)


par rastlin som dal do subkultury na ine medium a tiez sa chystaju kvitnut (mimochodom, ta, co bola farebna, zasa zozelenala):


U d. anglica taktiez prezilo vsetkych 28 rastlin, co som necakal, pretoze z TC boli vylahvene bez korenov. Vsetky zapustili korene v raseline a uz rastu. Rastliny z TC neupadaju do dormancie po vylahveni, je to tym ze nie su dospele?

No a na zaver moja Noemova archa pre d.ascendens, 40 semenacikov na mediu som spalil pravdepodobne vysokou teplotou, vceas som vylahvil 5 kuskov, z coho prezili 3-4. Z nich 2 rastu velmi pekne a su silne a zdrave:

Leošovi bylo jemně naznačeno , že by měl jít sednout na kolo a dojet dva kiláčky , že Dušo ?

S přátelským pozdravem Leoš Kohoutek

nikoli, Leoši, ta pozvánka byla určena určitě mně, že, Dušane?

me dvere jsou pro kazdeho otevreny dokoran (mimo zlodeju))